核酸電泳實(shí)驗(yàn)問(wèn)題有哪些？如何解決？

你知道核酸電泳實(shí)驗(yàn)問(wèn)題有哪些嗎？該如何解決呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、無(wú)條帶或幾乎看不到條帶

原因：

1.上樣染料掩蓋目標(biāo)條帶；

2.凝膠超限運(yùn)行；

3.電極反接；

4.染色敏感度低；

5.光源錯(cuò)誤。

解決方法：

1.檢查電泳中使用的加載染料的表觀遷移大小。因?yàn)槿玖峡赡軙?huì)掩蓋和隱藏目標(biāo)條帶，特別是在樣品量低的情況下。

2.監(jiān)測(cè)加載染料的運(yùn)行時(shí)間和遷移，以避免將較小的樣品分子從凝膠上運(yùn)走。

3.確保將電極正確連接至電源。設(shè)置水平凝膠時(shí)，凝膠孔應(yīng)與負(fù)極位于同一側(cè)。

4.檢查制造商提供的用于檢測(cè)核酸的熒光染色劑的靈敏度。

增加染色劑用量和/或延長(zhǎng)染色時(shí)間，使單鏈核酸顯色。或者，考慮對(duì)單鏈分子 具有 更高親和力的du特染色，以提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。

對(duì)于較厚或高百分比凝膠，應(yīng)延長(zhǎng)染色時(shí)間，以確保熒光染色劑充分滲透。

5.如果使用熒光染料進(jìn)行染色，請(qǐng)檢查其激發(fā)波長(zhǎng)以確保使用的光源對(duì)刺激染料進(jìn)行可視化來(lái)說(shuō)是最佳的。

二、條帶拖尾或擴(kuò)散（模糊）

原因：

1.上樣孔形成不佳；

2.樣品超載；

3.樣品溶于高鹽緩沖液；

4.樣品含有大量蛋白質(zhì)。

解決方法：

1.灌注凝膠前，應(yīng)適當(dāng)清潔凝膠梳。

不可將凝膠槽填充過(guò)滿，否則會(huì)導(dǎo)致上樣孔連接。

移除凝膠梳之前，應(yīng)預(yù)留足夠的上樣孔形成時(shí)間。

2. 在凝膠電泳中，不可使用過(guò)量樣品；每1毫米的凝膠孔寬度通常推薦0.1–0.2 μg的樣品用量。而拖尾、彎曲或U形條帶以及融合條帶均是過(guò)載凝膠的常見(jiàn)表現(xiàn)。

3. 檢查加載緩沖液的鹽濃度是否與選定的凝膠兼容。如有需要，可稀釋上樣緩沖液。

4. 存在于樣品中的蛋白質(zhì)可能會(huì)干擾凝膠中的樣品遷移率。通過(guò)純化樣品來(lái)去除蛋白質(zhì)，或者通過(guò)在裝有SDS的加載染料中制備樣品并在加載之前加熱來(lái)分離/變性蛋白質(zhì)。

三、條帶分離不佳

原因：

1. 未選擇最佳的凝膠類型

2. 凝膠類型錯(cuò)誤

3. 電壓過(guò)低或過(guò)高

4. 電泳時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)

解決方法：

1. 選擇更適合分離樣品的凝膠類型。推薦使用聚丙烯酰胺凝膠來(lái)解析核苷酸<1,000 bp。

2. 對(duì)于單鏈核酸（例如RNA）的電泳，制備用于有效分離的變性凝膠。對(duì)于雙鏈DNA的電泳，應(yīng)避免使用變性凝膠，以保護(hù)雙鏈結(jié)構(gòu)。

3. 施加電壓為建議的核酸的大小范圍和使用的運(yùn)行緩沖液。電壓過(guò)低或過(guò)高，都無(wú)法實(shí)現(xiàn)最佳的核酸分離。

4. 足夠長(zhǎng)的運(yùn)行凝膠以確保充分分離條帶。但電泳時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致過(guò)度加熱、樣品變性和條帶擴(kuò)散。

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